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【miRNA常见误区】茎环反转+SYBR定量?1+1<2

发布时间:2016-09-29 15:02 |  点击次数:

miRNA的荧光定量检测是几乎所有miRNA课题都避不开的实验过程。在提取miRNA之后,反转录可以用加尾法或茎环法,荧光定量可以采用染料法(SYBR Green)或探针法。为了增加反应的特异性,同时为了节省探针昂贵的合成费用,小明同学独创了一种实验流程:茎环法反转录,染料法荧光定量。

然而,11不一定等于2,两者兼顾的后果往往是两者都做不到位。就像我们提取RNA一样,过程的每一个步骤都需要去除RNase,而绝不是第一步去除了,后面就可以不管。对于miRNA的家族来说,彼此之间碱基差异很少,即使是茎环法也不能保证只反转家族中的某一条miRNA,所以最终的cDNA仍然有很大可能是混合物。此时,只有使用探针法才能严格保证特异性。如果后续采用染料法,那么前面的茎环法反转录的意义就大打折扣了。

另一方面,加尾法特异性低这个概念只是相对的。对于不同miRNA来说,最少要相差1个碱基,所以只要能完美区分单个碱基的差别,这个特异性就足够了。那么加尾法反转加染料法定量,其特异性究竟如何呢?我们来举个栗子。

另外,茎环法反转录还有很多其他的问题,最重要的是检测通量太低。

了解使用茎环法的血泪史,可单击这里

 

 

——小明!你既浪费了时间又浪费了经费,还没有拿到理想的结果!自觉点!

——老师,给我3个小时,我能用新试剂将功补过!

——先回来!什么试剂这么快?

 

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 区分度强:只针对单链RNA进行加尾和反转录,免除miRNA前体的干扰。

  通量高:一次反应即可反转录所有的miRNA及内参。

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 特异性强:识别单碱基的差异,完美区分家族中的不同miRNA

 通用性好:适用于各种类型的荧光定量PCR仪。