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关于熔解曲线,你不知道的都在这里

人阅读 发布时间:2021-04-09 11:35

在染料法定量扩增实验中,熔解曲线发挥着关键作用,它可以帮助我们判断反应是否有非特异扩增。那么熔解曲线的基本原理是什么呢? 

首先我们需要了解染料法荧光标记的作用原理。SYBR Green I 是应用最广泛的染料法荧光标记,可以广泛地结合到 DNA 双链的小沟中,从而发出比游离状态下强 1000 倍的荧光。因此,在 PCR 的延伸期,随着双链产物的不断增加,嵌入到双链中的荧光分子也不断增多,荧光信号的变化可以反映产物量的变化。

那么熔解曲线是如何产生的呢?在扩增结束后,荧光信号强度达到一个最高值,之后我们设置一段由 65℃逐渐升温到 95℃的程序,随着温度逐渐升高,DNA 双链逐渐解链为单链,从以上的原理我们知道,嵌入到双链中的荧光染料分子也会逐渐脱落下来,所以荧光信号强度逐渐下降。在某段温度时,双链迅速而大量地解链,荧光信号强度骤然下降,这段温度中,一半的双链解链的温度我们称为熔解温度(即 Tm 值)。最终,DNA 双链完全解链为单链,荧光值下降为一个本底水平,这一过程中的荧光信号随温度变化的曲线就是熔解曲线,称为原始图谱。该图谱做负导数换算后得到熔解曲线的导数图谱,导数图谱会出现熔解峰,熔解峰对应的温度就是 Tm 值。

 


不同的产物按照其 GC 含量,片段大小,盐离子浓度的不同,其对应的 Tm 值也是不同的。
熔解曲线为一个单一的尖锐峰,说明无非特异性荧光产生,此时定量准确。

 


熔解曲线出现杂峰,说明产生了非特异产物,荧光值不能反映目的产物量的值,此时定量不准确。至此,我们也就知道熔解曲线是双峰,Ct 值不能用来做进一步计算。
 

 


如果扩增出现非特异性荧光,可能的原因及排除方法有:

1. 引物设计不合理,存在非特异扩增或引物二聚体
——提高模板的加入量
——降低引物的加入量
——稍微提升退火温度
——重新设计合适的定量引物得到特异扩增产物

2. 体系存在杂质或者污染
——提取 RNA 之后进行 RNA 纯度和完整性鉴定,避免使用不纯的模板
——操作过程在超净台中进行,避免引入环境污染
——注意试剂的取用和保存,避免交叉污染

3. 试剂抗逆性较差
——选用高效的荧光定量试剂消除非特异性扩增
——优化反应条件和反应体系

TIANGEN 明星定量产品--SuperReal 荧光定量预混试剂增强版(SYBR Green)(FP205),采用化学修饰和抗体修饰的双热启动聚合酶,并辅以 K+ 和 NH4+ 平衡体系,扩增效率高,重复性好。更添加了独特的 H-Bond 因子,可以消除弱氢键,消除非特异结合,从而一定程度上消除非特异扩增,定量结果更准确。



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SuperReal 荧光定量预混试剂增强版 (SYBR Green) (FP205)
FastFire 快速荧光定量 PCR 预混试剂 (SYBR Green) (FP207)
Talent 荧光定量检测试剂盒 (SYBR Green) (FP209)


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反馈结果赢好礼
活动规则:
即日起至 4 月 30 日,提交使用以上荧光定量产品的定量结果(扩增曲线和熔解曲线),即有机会获得博物文创精美手账 1 份。(提交结果越详细获奖机会越大~)

提交结果案例:扩增曲线和熔解曲线

活动礼品:
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通过以下邮箱获取申请试用装链接和提交反馈结果链接。
邮件主题:申请试用装 或者 提交反馈结果
活动参与邮箱:Jianqin.Hao@tiangen.com.     
活动咨询电话:010-59822694

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