聚合酶链式反应（PCR）是分子生物学的基础实验技术之一，但如果忽略了其中的一些要点，即使是实验室里的大神，也会遇到目的序列扩增不出的情况。PCR 的成功与否与模板、引物、DNA 聚合酶及其他反应组分、反应条件这四大要素紧密相关，今天我们就一起梳理下 PCR 失败的主要原因和对策吧！

PCR 成功的四大要素及注意事项：

一、模板
1. 模板降解
1）尽量选择新鲜提取的模板进行 PCR 扩增，通过凝胶电泳检测模板的完整性，若降解严重需要重新制备模板；
2）模板避免反复冻融。

2. 模板中含有抑制 DNA 聚合酶活性的抑制剂
1）采用离心柱法提取核酸，纯化模板，消除抑制剂的干扰；
2）适当减少模板量，采用梯度稀释摸索最佳模板量；
3）选用抗逆性强的 DNA 聚合酶。

3. 模板量太低
1）适当增加模板量；
2）模板为 cDNA 时，选用目的基因表达量高的组织提取高质量 RNA 并选用基因克隆专用的反转录试剂盒得到的 cDNA 作为模板；
3）选用灵敏度高的 DNA 聚合酶。

4. 高 GC, 复杂模板
1）使用 PCR 添加剂（比如 DMSO，甜菜碱）或 GC enhancer，促进高 GC，复杂序列模板双链解离从而有利于引物退火和序列延伸；
2）增加变性时间或温度，使 DNA 双链彻底解离；
3）选用适用于高 GC，复杂模板扩增的 DNA 聚合酶。

5. 长片段
1）确保模板的完整性；
2）选择适用于长片段扩增的 Taq DNA 聚合酶或者超强高保真 DNA 聚合酶；
3）在试剂盒说明书建议的延伸速度基础上适当延长延伸时间；
4）采用抑制热交错 PCR（Suppression Thermo-Interlaced PCR, STI PCR）策略。


二、引物

1. 引物降解
1）重新合成高质量引物，少量分装保存，防止多次冻融，避免长期置于冰箱冷藏部分。

2. 引物设计不合理
1）建议使用引物设计软件（比如 Primer premier 6, Oligo 7 等）设计并选取评分较高的引物；
2）确保引物和模板结合的特异性。

三、DNA 聚合酶及其他反应组分

1. DNA 聚合酶选择不合适
1）根据实验目的选择合适的 DNA 聚合酶，比如分子克隆实验中涉及到序列的高保真扩增，需要选择一款针对不同类型序列具有普适性的高保真酶。

2. DNA 聚合酶活力下降
1）检查试剂是否过期，按照说明书要求合理保存试剂。

3. 反应缓冲液体系与目的基因不匹配
1）不同目的 PCR 反应要求反应缓冲液中的镁离子、钾离子、铵离子、化学添加剂等成分浓度是不一样的，建议使用试剂盒中优化好的缓冲液体系。

四、反应条件
1. 退火温度不合适，影响引物与模板特异结合
1）使用引物设计软件建议的退火温度，退火温度一般比引物的 Tm 值低 5 ℃；
2）不同的试剂盐离子浓度不同，最佳的退火温度可能存在差异，建议以软件建议退火温度为中心设置温度梯度，来获得最佳退火温度；
3）设置降落 PCR（Step-down）反应程序。

2. 其他反应条件不合适
1）不同的 DNA 聚合酶试剂最佳反应条件是有差别的，选用试剂说明书建议的变性温度和时间，退火时间，延伸温度和速度，循环数。

可见在一个成功的 PCR 实验里，模板、引物、DNA 聚合酶、反应条件这四个要素缺一不可，尤其对于一些保真度要求高的长片段、或是一些高 GC 含量的复杂模板，选择一款合适的 DNA 聚合酶又起到至关重要的作用。

是的，TIANGEN 带着它的超强高保真 PCR 试剂盒（KP213），向我们走来了！助力你登上 PCR 的实验室一霸的宝座！它具有以下五个特点：

高保真性：为 Taq 聚合酶的 180 倍。
模板普适性：能够识别 GC 含量 30%～80%的不同物种 DNA 片段。
延伸力强：可扩增长至 20 kb 的 DNA 片段。
高灵敏度：基因组模板用量可低至 1 ng。
操作简便：只需加入模板和引物，轻松配好体系，PCR 产物平末端，纯化后可直接用于无缝克隆。

下面请看真实有效的实验案例：

1. 不同的酶保真性比较

采用 KP213 和市场主流产品扩增 4kb DNA 片段（35 个循环），产物用 TIANGEN PCR-free 建库试剂盒进行建库，illumina 平台测 1G 数据量，后续根据各产品扩增碱基突变率得出产品的保真性。TIANGEN KP213 保真性可达 Taq 酶的 180 倍。


2. 普适性比较


使用不同高保真酶分别扩增不同来源、不同长度的片段。结果显示，KP213 在扩增能力、特异性、普适性、长片段扩增效率方面的综合性能表现优秀。
A: TIANGEN KP213; B: TY 公司高保真酶；C: K  公司高保真酶。模板上样量: 基因组 DNA, 200 ng; Lamda DNA, 50 ng。
M: TIANGEN D15000 Marker。1: 0.75 kb; 2: 1 kb; 3: 2 kb; 4: 3.9 kb; 5: 6 kb; 6: 0.48 kb (GC 75%); 7: 1.5 kb (GC 71%); 8: 2 kb; 9: 8.2 kb; 10: 2.3 kb; 11: 2 kb; 12: 3 kb; 13: 8.2 kb; 14: 8.1 kb; 15: 15 kb。


3. 高低 GC 模板适应性

采用超强高保真酶 Ⅱ 扩增不同 GC 含量（30%～79%）的目的序列，都能得到特异性扩增产物
M: TIANGEN DNA Marker Ⅳ。
1: 0.4 kb, GC 75%; 2: 0.7 kb, GC 30%; 3: 1.1 kb, GC 79%; 4: 1.5 kb, GC 71%; 5: 1.9 kb, GC 72%; 6: 2.4 kb, GC 35%; 7: 3.9 kb, GC 70%; 8: 4.1 kb, GC 65%。


4. 长片段扩增能力

以水稻基因组和cDNA为模板，采用超强高保真酶Ⅱ扩增不同长度的目的序列，都能扩出目的产物。
M: TIANGEN D15000 Marker。 1-4: 模板为水稻基因组DNA; 5-7: 模板为水稻 cDNA。
1: 8.3 kb; 2: 13.3 kb; 3: 13.9 kb; 4: 16.5 kb; 5: 5.3 kb; 6: 6.5 kb; 7: 12.9 kb。



参考文献：
[1] Zhao Z., Xie X., Liu W., Huang J., Tan J., Yu H., Zong W., Tang J., Zhao Y., Xue Y., Chu Z., Chen L., and Liu Y.-G. (2022). STI PCR: an efficient method for amplification and de novo synthesis of long DNA sequences. Mol. Plant. doi: https://doi.org/10.1016/j.molp.2021.12.018.