小RNA建库方法集锦：从经典到前沿，附科研利器推荐

为助您精准匹配研究目标与最优建库方案，本文简单梳理了当前主流Small RNA建库策略的流程、优势与局限，涵盖连接法、非连接法与靶向捕获法三大技术路线，带您了解Small RNA建库背后的“门道”。

1.经典连接法

经典连接法建库包括3´端接头连接、5´端接头连接、反转录cDNA合成、PCR富集和片段筛选步骤，技术成熟、分析流程稳定，适用于多数常规miRNA测序项目。但是存在一些核心痛点：连接偏好性导致特定序列连接效率差异；PCR扩增偏倚影响定量准确性；接头二聚体占比偏高，数据有效率低。

2.升级版连接法

在经典连接法基础上进行不同策略的定向优化，提升连接法建库效果。

01.接头封闭法

3´端接头连接后增加3´端接头封闭步骤或者去除步骤，可以有效降低接头二聚体占比，提升连接的特异性和准确性，数据有效率也有较大提升。

随机核苷酸接头连接法建库流程图^[2]

 

03.单接头环化建库法

使用单个接头连接后反转录cDNA合成、环化，然后进行PCR富集。流程只需一次连接反应，可以有效降低5´端连接偏倚，同时减少接头二聚体的产生。

单接头环化建库流程图^[3]

 

04.UMI校正法

接头连接或者反转录时引入的分子标识符（UMI），可在数据分析时消除PCR扩增偏倚，定量更为准确。

 

含UMI的建库流程图^[4]

 

3.无连接法建库

该方法摒弃连接步骤，采用5´端加帽，3´端加polyA尾+模板转换逆转录策略直接合成cDNA。优势：偏好性低，更适于极微量建库；劣势：成本高，miRNA比对率偏低。

无连接法建库流程图^[5]

 

4.靶向探针捕获法

通过设计特异性探针捕获目标miRNA，避免非特异性连接或扩增；显著提升比对率和检测灵敏度，但仅限于已知miRNA的检测分析，多应用于医学研究。

TIANGEN针对Small RNA建库经典连接法的核心痛点，对接头连接反应体系及反转录体系进行多次优化，有效降低连接偏倚与PCR偏倚，助力科研用户获得更可靠的分析结果。