EasyGeno技术手册

载体构建是分子生物学研究中最常用的实验技术，是分子生物学研究常用的手段之一。目前常用载体构建技术主要包括基于限制性内切酶/DNA连接酶的酶切连接技术，基于DNA拓扑异构酶的TOPO技术，以及基于DNA序列同源性的重组技术等。

 

酶切/连接技术——自制的老式克隆技术

基于II型限制性内切酶能够在DNA末端产生特定的粘性末端或平末端的原理，将不同来源的DNA分子使用同一限制性内切酶进行酶切，形成相同的末端序列（通常为粘性末端）。粘末端互补拼接后，再利用T4 DNA 连接酶催化两条相邻双链DNA分子的3' -P和5' -OH产生磷酸二酯键，从而将特定的两条DNA序列连接在一起。

优点：能够进行片段的定向克隆、应用广泛

缺点：

• 受酶切位点限制

• 需多步酶切/纯化，操作复杂，耗时长

• 效率较低，长片段连接较难

• 一次只能将单一片段构建进入载体

 

TOPO技术——载体受限的不定向快速克隆技术

基于拓扑异构酶的磷酸二酯键能够被双链DNA的5' -OH所攻击，形成新的磷酸二酯键的原理，将两条不同来源的DNA分子连接起来，从而完成载体构建。

优点：连接反应快速、操作简便

缺点：

• 只适用于特定载体

• 插入不能定向（定向插入需特殊引物设计，定向载体价格昂贵）

• 只能将单一片段构建进入载体

• 需控制反应时间，超时连接易损伤载体

 

EasyGeno重组技术——不受载体限制的快速定向克隆技术

EasyGeno快速重组克隆试剂盒中所包含的混合酶可将载体和片段的同源区域在双链的3' 端进行重组连接，最终得到无缺口闭环质粒，可直接转化感受态细胞，筛选克隆。EasyGeno重组技术可实现单插入片段的定向重组进入载体、多片段同时定向构建进入载体、规模化的高通量载体构建、载体改造中的点突变及区段突变等。

EasyGeno重组技术特点：

• 不受酶切位点限制，不受载体限制

• 一步反应，15分钟实现载体和片段的重组

• 效率是传统酶切/连接方法的5-10倍

• 可同时实现1-5个片段的定向插入

• 可实现规模化载体构建